非洲豬瘟的實(shí)驗(yàn)室診斷
由于非洲豬瘟缺乏預(yù)防用疫苗，為防止疫病的傳播，就需要實(shí)施嚴(yán)格的衛(wèi)生和生物安全控制措施，而這就依賴于疫病的快速、可靠的早期診斷。ASF 的診斷是指確診動(dòng)物正在感染，或者曾經(jīng)感染過(guò)ASFV。因此，適用的診斷技術(shù)包括檢測(cè)和識(shí)別ASFV 特異性抗原、DNA 或抗體的技術(shù)，所獲取的檢測(cè)信息也是控制和根除計(jì)劃的重要保障。在選擇診斷技術(shù)時(shí)，分析疫病感染期非常重要( 圖30)。由于感染動(dòng)物所處的感染期不同，因此在疫情和控制/ 根除計(jì)劃中，需要同時(shí)檢測(cè)病毒和抗體以確保準(zhǔn)確性。
根據(jù)報(bào)道，ASF 的自然感染潛伏期為4~19 天。在臨床癥狀出現(xiàn)的兩天前，ASF 感染動(dòng)物開(kāi)始散播大量病毒。病毒散播因所感染的ASFV 毒株毒力不同而異。感染后約7-9 天血清轉(zhuǎn)陽(yáng)，抗體陽(yáng)性可持續(xù)終生( 圖30)。
病原學(xué)檢測(cè)為陽(yáng)性( 即抗原) 則表明，所檢測(cè)的動(dòng)物在取樣時(shí)正在發(fā)生感染。而抗體檢測(cè)陽(yáng)性則表明感染正在或者已經(jīng)發(fā)生，包括感染后已經(jīng)恢復(fù)的動(dòng)物( 且
可能終身保持血清陽(yáng)性)。
自2015 年底以來(lái)，東歐血清學(xué)流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示血清學(xué)陽(yáng)性動(dòng)物的檢出率顯著增加，特別是在發(fā)生疫情的歐盟國(guó)家的野豬群體中尤為明顯。這些結(jié)果表明，ASF 感染耐過(guò)動(dòng)物可存活超過(guò)一個(gè)月并可能出現(xiàn)亞臨床感染的病例，就像在伊比利亞半島、美洲和非洲之前所描述的情況。因此，抗體檢測(cè)技術(shù)對(duì)于實(shí)施控制和根除計(jì)劃所需的完整信息而言是必要的。
非洲豬瘟病毒檢測(cè)
應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR) 檢測(cè)非洲豬瘟病毒基因組
PCR 已成功應(yīng)用于豬樣品(血液、器官等)和蜱中ASFV 基因組的檢測(cè)。病毒DNA 片段通過(guò)PCR 擴(kuò)增獲得足以檢測(cè)的量，從而實(shí)現(xiàn)檢測(cè)。所有經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的PCR 技術(shù)均可以在臨床癥狀出現(xiàn)前實(shí)現(xiàn)檢測(cè)。PCR 能在樣品到達(dá)實(shí)驗(yàn)室數(shù)小時(shí)內(nèi)，完成ASF 的診斷。PCR 是可以代替病毒分離鑒定的一種靈敏、特異、快速的ASFV 檢測(cè)技術(shù)。同時(shí)，相比于抗原檢測(cè)技術(shù)，如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和直接熒光抗體測(cè)試(FAT)，具有更高的敏感性和特異性。需要注意的是，PCR 的高度敏感性使其容易發(fā)生交叉污染，應(yīng)該采取適當(dāng)?shù)念A(yù)防措施來(lái)減少和
控制污染風(fēng)險(xiǎn)的發(fā)生。
OIE 在《陸生動(dòng)物診斷試驗(yàn)和疫苗手冊(cè)》(2016 年)中推薦使用的常規(guī)和實(shí)時(shí)熒光PCR 得到了長(zhǎng)期的充分驗(yàn)證，是常規(guī)診斷的重要工具。此外，除了OIE 推薦的適用于康復(fù)動(dòng)物ASF 基因組檢測(cè)的實(shí)時(shí)熒光PCR 技術(shù)外，其他研究者建立的實(shí)時(shí)熒光PCR 已經(jīng)證實(shí)更為敏感。在這些分子技術(shù)中使用的引物和探針多以VP72 編碼區(qū)域作為靶基因設(shè)計(jì)，該基因片段是ASFV 基因組中研究清楚，且高度保守的區(qū)域。應(yīng)用這些PCR 技術(shù)，即使在滅活或降解的樣品中也可檢測(cè)到已知所有22 種p72 病毒基因型的多個(gè)毒株。
對(duì)于特急性、急性或亞急性ASF 感染病例， PCR 是首選的檢測(cè)技術(shù)。此外，由于PCR 檢測(cè)病毒基因組，即使病毒分離鑒定為陰性的、含有無(wú)感染性病毒粒子的樣品，也可完成檢測(cè)，這也使其成為用于檢測(cè)感染低或中等毒力毒株的重要工具。雖然聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)不能提供病毒感染性的信息，但可以提供定量的信息。
非洲豬瘟病毒分離
病毒分離是將樣品接種易感的豬源原代細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞而進(jìn)行的檢測(cè)。如果在樣品中存在ASFV，則會(huì)在易感細(xì)胞中復(fù)制，在感染細(xì)胞中產(chǎn)生細(xì)胞病變(CPE)。細(xì)胞裂解和細(xì)胞病變(CPE) 通常在出現(xiàn)紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象的48-72 小時(shí)后發(fā)生。ASFV 的紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)是該病毒特有的檢測(cè)技術(shù)，其他豬源病毒在白細(xì)胞培養(yǎng)物中不存在紅細(xì)胞吸附特性。當(dāng)病毒在這些培養(yǎng)物中復(fù)制時(shí)，多數(shù)ASFV 毒株會(huì)產(chǎn)生紅細(xì)胞吸附反應(yīng)(HAD)，在感染的白細(xì)胞周圍吸附豬紅細(xì)胞形成 “玫瑰花環(huán)”( 圖31)。
此外，需要說(shuō)明的是，在沒(méi)有發(fā)生紅細(xì)胞吸附反應(yīng)的時(shí)候出現(xiàn)CPE，可能是由于接種物的細(xì)胞毒性所致，或者由于其他病毒如偽狂犬病毒的感染，或者由于不產(chǎn)生紅細(xì)胞吸附反應(yīng)的ASFV 毒株導(dǎo)致。一旦發(fā)生這類情況，必須采用其他的病毒學(xué)檢測(cè)技術(shù)如FAT 或PCR，檢測(cè)細(xì)胞沉淀物是否存在ASFV。而如果細(xì)胞分離沒(méi)有觀察到任何變化，或者FAT 和PCR 檢測(cè)為陰性，則需要將細(xì)胞培養(yǎng)上清– 再次接種新的培養(yǎng)物種，連續(xù)傳代3-5 代，之后方可確認(rèn)為ASFV 陰性。
對(duì)于抗原檢測(cè)(ELISA、PCR 或FAT)為陽(yáng)性的樣品，推薦HAD 為完成病毒分離和鑒定的參考試驗(yàn)。而如果通過(guò)其他方法已經(jīng)證實(shí)ASF 感染，特別是在首次暴發(fā)ASF 的地區(qū)，也建議使用紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)鑒定病毒。此外，病毒分離對(duì)于進(jìn)一步的分子生物學(xué)研究也是必要的基礎(chǔ)。
直接熒光抗體法對(duì)非洲豬瘟抗原的檢測(cè)
FAT 可用于檢測(cè)豬組織中的ASFV 抗原。檢測(cè)原理是通過(guò)顯微觀察感染臟器涂片或薄層冷凍切片上的病毒抗原實(shí)現(xiàn)的。使用異硫氰酸熒光素(FITC)結(jié)合的特異性抗體檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)抗原。FAT 也可用于檢測(cè)未觀察到HAD 的白細(xì)胞培養(yǎng)物中的ASFV 抗原，因此可以鑒定不產(chǎn)生HAD 反應(yīng)的ASFV 毒株。FAT 還可用于鑒別CPE 是由ASFV 感染導(dǎo)致的，還是由其他病毒感染或者導(dǎo)致的接種的細(xì)胞毒性導(dǎo)致的。
陰陽(yáng)性對(duì)照是保證切片被正確判定的重要保障。該方法也是對(duì)特急性和急性ASF 病例的高度敏感的檢測(cè)技術(shù)，且可以非常快速的完成檢測(cè)。雖然FAT 是高效的檢測(cè)技術(shù)，但目前已被PCR 逐步取代，所需試劑也不再?gòu)V泛使用。然而值得一提的是，在亞急性和慢性型感染中，F(xiàn)AT 的敏感性明顯降低(40%)。
ELISA 對(duì)非洲豬瘟抗原的檢測(cè)
也可以使用ELISA 檢測(cè)病毒抗原，其成本比PCR 更為低廉，并且可在沒(méi)有特殊的實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備的條件下，短時(shí)間內(nèi)對(duì)樣品的大規(guī)模篩查。然而，與FAT 相似，對(duì)于亞急性和慢性病例，抗原ELISA 的敏感性明顯較低。同時(shí)，現(xiàn)地樣品通常狀態(tài)不佳，因此也降低了檢測(cè)的敏感性。因此建議抗原ELISA(或其他ELISA)主要用于 “群體”檢測(cè)，并輔助以其他病毒學(xué)和血清學(xué)檢測(cè)。
非洲豬瘟抗體檢測(cè)
血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)因其簡(jiǎn)便、低成本和無(wú)需特殊的儀器設(shè)備，而成為最常用的檢測(cè)技術(shù)。由于ASF 尚沒(méi)有可用的疫苗， ASFV 抗體陽(yáng)性即表明當(dāng)前或者曾經(jīng)發(fā)生了感染。此外， ASFV 抗體在感染早期即可出現(xiàn)，并持續(xù)數(shù)年。然而，在特急性和急性感染中，豬通常在抗體轉(zhuǎn)為陽(yáng)性前已死亡。因此，在疫病暴發(fā)的早期階段，建議采集樣品檢測(cè)病毒DNA。
對(duì)于檢測(cè)ASF 抗體，推薦使用ELISA 篩查抗體陽(yáng)性樣品，并采取免疫印跡試驗(yàn)(IB)或間接熒光抗體(IFA)試驗(yàn)進(jìn)行確認(rèn)。此外，間接免疫過(guò)氧化物酶的抗體檢測(cè)技術(shù)也可用作豬血清和組織滲出物中ASF 抗體檢測(cè)的替代試驗(yàn)。該技術(shù)也適用于大量樣品的檢測(cè)，而無(wú)需昂貴的熒光顯微鏡設(shè)備，且敏感性較高。
ELISA 對(duì)非洲豬瘟抗體的檢測(cè)
ELISA 是一種常用的檢測(cè)技術(shù)，廣泛用于多種動(dòng)物疫病的大規(guī)模血清學(xué)調(diào)查。該方法的顯著特點(diǎn)是靈敏度高、特異性好、速度快、成本低，結(jié)果清晰。借助于自動(dòng)化設(shè)備的使用，可以實(shí)現(xiàn)大量樣品的快速篩選。
ELISA 使用標(biāo)記物檢測(cè)血清樣品中的ASF 抗體。ELISA 使用的標(biāo)記通常是某種酶。當(dāng)抗原和抗體彼此結(jié)合時(shí)，酶引起底物發(fā)生顏色變化，從而鑒定ASF 陽(yáng)性樣品。目前，多種用于ASF 抗體檢測(cè)的間接或阻斷ELISA 已實(shí)現(xiàn)商品化供應(yīng)，或者由實(shí)驗(yàn)室“自主”建立。
血清處理或保存不當(dāng)(儲(chǔ)存或運(yùn)輸不當(dāng))，如溶血樣品可能會(huì)產(chǎn)生高達(dá)20%的假陽(yáng)性結(jié)果。因此，通過(guò)ELISA 檢測(cè)的所有陽(yáng)性和可疑樣品必須通過(guò)其他血清學(xué)替代試驗(yàn)確認(rèn)。
免疫印跡試驗(yàn)(IB)技術(shù)是用于蛋白質(zhì)檢測(cè)和鑒定的快速、靈敏的檢測(cè)技術(shù)。IB 技術(shù)的原理是抗原抗體的特異性結(jié)合。IB 技術(shù)中使用了覆蓋有病毒抗原的紙條，首先是抗原溶解、電泳分離、以及轉(zhuǎn)移到薄膜上(通常是硝化纖維素膜)，之后與特異性一抗反應(yīng)，再與標(biāo)記二抗作用后，產(chǎn)生可直接觀察的陽(yáng)性反應(yīng)條帶。
ASFV 感染后首先刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體的多種病毒蛋白，通過(guò)在IB 試驗(yàn)，可在所有感染動(dòng)物中標(biāo)定地檢測(cè)到。動(dòng)物感染后7-9 天血清轉(zhuǎn)陽(yáng)，并可在康復(fù)動(dòng)物體內(nèi)存在幾個(gè)月。接種其他病毒疫苗的動(dòng)物血清，可能會(huì)產(chǎn)生非特異性反應(yīng)，因此需要借助于如IPT 或者FAT 等技術(shù)進(jìn)行確認(rèn)。
間接熒光抗體試驗(yàn)(IFA) 對(duì)非洲豬瘟抗體的檢測(cè)
該技術(shù)的原理是用具有細(xì)胞適應(yīng)性的ASFV 毒株，感染單層綠猴腎細(xì)胞，再通過(guò)特異性抗原抗體反應(yīng)實(shí)現(xiàn)對(duì)ASF 抗體的檢測(cè)。抗原抗體反應(yīng)通過(guò)耦聯(lián)的熒光素進(jìn)行檢測(cè)。陽(yáng)性樣品在感染細(xì)胞的胞漿中出現(xiàn)特異性熒光。IFA 是一種快速、高度敏感和特異的ASF 抗體檢測(cè)技術(shù)，適用于血清、血漿或組織分泌物中抗體的檢測(cè)。
間接免疫過(guò)氧化物酶試驗(yàn)(IPT) 對(duì)非洲豬瘟抗體的檢測(cè)
免疫過(guò)氧化物酶試驗(yàn)(IPT) 是一種細(xì)胞免疫化學(xué)技術(shù)，細(xì)胞固定后通過(guò)耦聯(lián)的過(guò)氧化物酶實(shí)現(xiàn)抗原抗體復(fù)合物的檢測(cè)。在IPT 反應(yīng)過(guò)程中，綠猴腎細(xì)胞感染了適應(yīng)于這些細(xì)胞的ASFV 適應(yīng)株。感染細(xì)胞首先被固定，之后用作抗原以確定樣品是否存在針對(duì)ASF 的特異性抗體。與FAT 檢測(cè)一樣，IPT 是具有高度的敏感性和特異性的快速檢測(cè)技術(shù)，適用于從血清、血漿或組織滲出液中檢測(cè)ASF 抗體。但因?yàn)椴捎昧嗣笇W(xué)顯色系統(tǒng)，其結(jié)果判定比FAT 更為簡(jiǎn)單。
綜上所述，目前可用的診斷技術(shù)可通過(guò)綜合病毒和抗體檢測(cè)來(lái)確診ASF。實(shí)時(shí)熒光PCR 是最廣泛應(yīng)用的病毒學(xué)診斷技術(shù)，可敏感、特異、快速的實(shí)現(xiàn)ASFV 核酸的檢測(cè)。
由于存在交叉污染的可能，來(lái)自無(wú)疫區(qū)的單個(gè)動(dòng)物(例如野豬)的PCR 陽(yáng)性，或在一群動(dòng)物中出現(xiàn)的單個(gè)PCR 陽(yáng)性樣品，應(yīng)采取其他的病毒檢測(cè)方法，以及結(jié)合血清學(xué)、病理學(xué)和流行病學(xué)調(diào)查的結(jié)果綜合確診。由于PCR 所檢測(cè)到的陽(yáng)性是病毒核酸陽(yáng)性，而不是感染性病毒粒子，因此，在PCR 之外，強(qiáng)烈推薦新的意思感染地區(qū)。在報(bào)告發(fā)生疫情前，先從感染樣品中分離獲得病毒以確認(rèn)。
雖然經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的ELISA 是檢測(cè)ASF 抗體的候選技術(shù)，特別是對(duì)血清樣品的初步篩查，但應(yīng)時(shí)刻注意檢測(cè)的局限性。應(yīng)使用其他的確證試驗(yàn)，如IB、IFA 或IPT，以發(fā)現(xiàn)ELISA 檢測(cè)中的假陽(yáng)性樣品。此外， IFA 和IPT 是組織滲出液和血漿樣品檢測(cè)的首選技術(shù)，因?yàn)樗麄兡芡暾故玖餍胁W(xué)過(guò)程，并可確定感染的具體時(shí)間。
ASF 準(zhǔn)確的診斷必須包括病毒學(xué)和血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果，同時(shí)結(jié)合臨床、病理和流行病學(xué)的調(diào)查結(jié)果。表5 總結(jié)了ASF 的主要實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)及其特性。
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1. HR8000免疫定量速測(cè)儀
2. 霉菌毒素檢測(cè)試紙卡：黃曲霉毒素（AFB1）、嘔吐毒素（DON）、玉米赤霉烯酮（ZEN）、T-2毒素（T-2）、伏馬毒素（FUM）、赭曲霉毒素（OTA）
3. 寵物疫病抗原檢測(cè)試紙卡：犬瘟熱病毒、犬細(xì)小病毒、犬冠狀病毒、貓瘟病毒、貓冠狀病毒等。
4. 豬病檢測(cè)試紙卡：豬瘟抗體檢測(cè)試紙卡、豬藍(lán)耳病抗體檢測(cè)試紙卡、豬口蹄疫抗體檢測(cè)試紙卡等
5. 禽病檢測(cè)試紙卡：禽流感H9亞型抗體檢測(cè)試紙卡、雞毒支原體抗體檢測(cè)試紙卡、雞滑液支原體抗體檢測(cè)試紙卡等。
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歡迎國(guó)內(nèi)外各界朋友加盟、垂詢及蒞臨指導(dǎo)。
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